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动植物油脂都可作生物柴油的原料，天然油脂的分子结构是含双键或不含双键的直链脂肪酸三甘油酯，碳链长度在12~26碳数，一般为偶数碳链。世界上已经确认的油料作物有350种之多。美国的生物柴油原料主要是以大豆油为主，美国政府通过对生物柴油的补贴，实现联邦政府对中部州的农业补贴。
根据欧盟与美国在1992年乌拉圭回合谈判中达成的Blair House Agreement，欧盟必须降低其对粮食补贴面积，近10 耕地面积的土地只能用于种植工业或非食用油料作物，这部分土地大部分用于种植油菜生产生物柴油。根据自然条件不同和农业政策不同，不同国家和地区采用的原料也不同，如巴西以蓖麻油_1 、南非以葵花子油、Nicaragua以Jatropha curcas油为原料生产生物柴油l1引。
国内生物柴油的生产才刚刚开始，根据地区不同原料变化较大，菜籽油、棉籽油、大豆油、椰子油、麻疯果油、葵花籽油等均被作为生物柴油原料，注意力更多地集中在野生植物油(如麻疯果油、乌桕油、黄连木果油[1。]等)和一些不能食用的副产油料(如花椒油、烟籽油、蓖麻油、棉籽油等)上。
原料对生物柴油的质量有一定的影响，油脂中所含的脂肪酸的碳链长短、不饱和键的多少直接影响生物柴油的闪点、十六烷值、倾点等性质。不同产地、不同品种的油脂化学成分有很大的区别，如我国油菜多是高含硫高芥酸油菜籽，芥酸含量可高达40 9／6～50 [1 。植物油一般含有大量的不饱和脂肪酸，如有4个共轭烯键的芥酸、有3个共轭烯键亚麻酸等，这些不饱和脂肪酸容易被空气氧化，会给生物柴油带来稳定问题。动物油脂则具有较高的饱和脂肪酸含量，当作为生物柴油原料时，饱和脂肪酸又会对生物柴油的黏度、凝点等指标产生影响。Allen等[15]甚至发现油脂中脂肪酸的组成与生物柴油的表面张力可以定量拟合。