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脂肪干细胞向神经前体细胞分化的实验方案二：实验步骤

青岛西凯生物技术有限公司于2010年，是一家以干细胞，免疫细胞为核心，结合jing准医疗，致力于“家族生命健康管理”，专注于“干细胞的研发储存及应用”，设有再生医学zhong心、综合性干细胞库、西凯生物干细胞抗衰美容临床研究转化基地和培训zhong心。

1、提取制备脂肪干细胞：向脂肪标本储液瓶中加入标本洗涤液，重复3~4次，直到洗出的废液比较澄清为止。将洗涤后的脂肪均等的分装到各个离心管中，每个管中加入等量的胶原酶溶液，无菌情况下置入37℃恒温振荡培养箱中消化30~60min。将消化好的脂肪放入离心机里离心分离，去除上层脂肪及废液，用DMEM悬浮细胞，用100um的滤网过滤掉余下的脂肪组织。吸取过滤后的细胞悬液少许进行计数，再次离心过滤后的细胞悬液。弃去上清，留少量原液，用手指轻弹悬浮细胞。再按接种瓶数加适量培养液悬浮细胞，分装入各个培养瓶中，并再在每个培养瓶中加入适量完全培养液，置37℃5%CO2培养箱培养。

2、诱导检测：消化传代取细胞，取P2代脂肪干细胞，以5*105cells接种于50cm2培养瓶中，分别加入上述各组诱导剂，每组复6孔，每隔3-4天换液一次，连续诱导分化，于第7天用流式检测脂肪干细胞特异表达因子CD49d，及神经前体细胞标记nestin。

3、动物实验：取上述nesting含量zui高组为供试品组，以生理盐水为空白对照，以脂肪干细胞为阳性对照，经尾静脉注射，饲养30天，以观察各组是否具有毒副作用。阳性对照组为避免因单次注射细胞量过大而导致动物出现死亡，因此实验分高（1*107）、中（1*106）、低（1*105）三个剂量注射，每组4只，每次注射2ml。