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SILAC-IP免疫共沉淀实验原理


在分离纯化诱饵蛋白-互作蛋白复合物过程中，不可避免地会出现非特异结合蛋白，这些蛋白会一并被质谱鉴定出来，成为假阳性的互作蛋白，影响后续挑选验证。 传统的判断假阳性互作蛋白方法是：用诱饵蛋白组鉴定到的蛋白列表，扣除掉对照组鉴定到的蛋白列表，作为“互作蛋白”。但很多真实的互作蛋白，比如丰度比较高的蛋白，在对照组中也会出现，而传统的方法就会被排除掉。

SILAC技术是先将实验组和对照组的蛋白带上不同的同位素，即重链、轻链氨基酸蛋白。复合物分离后，混在同一管中做酶切质谱等。这样既能鉴定到复合物蛋白，又能根据同位素峰强度判断诱饵蛋白组和对照组中蛋白的相对含量，从而更准确地判断出互作蛋白。



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SILAC-IP实验技术方案

不同的实验背景和目的需对应用不同方案，辉骏生物提供以下三种SILAC-IP实验方案：



方案一：以野生型细胞株为实验材料


1．分别用轻、重链氨基酸培养细胞，取等量标记好的细胞提取蛋白质；
2．提取的轻链、重链细胞总蛋白分别用Normal IgG和抗bait蛋白的特异抗体做Co-IP；
3．混合轻、重链Co-IP产物；
4．胰酶酶切，LC-MS/MS鉴定和定量蛋白。


案二：以过表达诱饵蛋白的细胞株为实验材料


1. 分别用轻、重链氨基酸培养正常对照细胞和过表达诱饵蛋白的细胞株(带标签)，取等量标记好的细胞分别提取蛋白质，并再次定量；
2. 取等量蛋白混合，用诱饵蛋白抗体做Co-IP；
3. 收集Co-IP后的蛋白液，胰酶酶切，LC-MS/MS鉴定和定量蛋白。

方案三：以干扰诱饵蛋白的细胞株为实验材料


1. 分别用轻链、重链氨基酸培养RNAi 诱饵蛋白的细胞株和正常对照细胞株，取等量标记好的细胞分别提取蛋白质，并再次定量；
2. 取等量蛋白混合，用诱饵蛋白抗体